HTCD 高通量圆二色测量系统

概要

 

对于制药，生物技术和食品化学实验室的科研人员，需要可重复的自动化测量和可靠的结构分析软件，高通量圆二色光谱（HTCD）系统消除了测量采集和生物分子表征中的人为错误和偏差。

 

 

功能

 

自动化蛋白质筛选

 

二级和三级结构的评价是蛋白质和肽生物制品质量检测的重要内容。圆二色（CD）对生物分子的不对称性 很敏感，是药物稳定性和加工研究的理想选择，在这些研究中，即使分子或其环境发生微小的变化，也会引起结构变化，改变其功能。虽然CD测量是众所周知的快速和容易的，但高通量系统通过使用两个96微孔板和120小瓶进行全自动化测量，显著增加了获得的数据量，消除了人为测量带来的偏差。

 

 

HTCD允许使用预先设定的参数进行自动扫描测量。自动进样器可将 微孔板架或小瓶架设置恒定的温度，以避免样品变性或蒸发，系统外壳具有互锁功能，以防止伤害操作员。该冲洗方法是预先为蛋白质或DNA/RNA样品设计的，可彻底消除样品残留。此方法也可使用多达三种冲洗溶剂进行定制。该系统允许样品在测量后进行回收，可批量处理数据包括二级结构和相似性分析。

 

 

 

系统配置

 

高级功能

 

全自动测量多达192个样品（两个96孔微孔板），或120个样品瓶

可选择预先登记的蛋白质或DNA/RNA样品冲洗方法，以彻底消除样品残留

J-1500CD光谱仪强大的升级改造能力

流量监测功能，可优化样品流量条件

 

 

序列程序可以在Spectra Manager™上创建，并可以 使用电子表格导入。

 

自动优化空气体积量

通过吸光度测量自动（或手动）确定将样本加载到流通池的空气体积，从而实现样品体积优化。此功能有助于减少死体积。

 

预定程序的冲洗功能

该冲洗方法是预先为蛋白质或DNA/RNA样品设计的，以消除样品残留，该方法也可使用多达三种冲洗溶剂进行定制。

 

 

验证和数据可信度

依靠数据的准确性和可重复性。集成验证模式为用户提供了多达九项仪器性能和校准测试的列表。每套J-1000系统都包括一个内置的汞灯波长校准源。JASCO还提供了一种标准样品（d-10-樟脑磺酸铵），用于吸光度准确性和重复性测试。

 

BeStSel CFR程序（选配）

最近，András Micsonai等人开发了BeStSel算法，该算法可以通过考虑β-strands的平行-反平行取向和反平行β-sheets的扭曲，从CD光谱中准确估计二级结构组成。Spectra Manager™ CFR为CD光谱仪提供了一个控制和分析平台，该平台与GxP兼容，并满足ALCOA+实践的计算机系统验证（CSV）、电子记录/电子签名（ER/ES） 和数据完整性（DI）。

 

qHOS程序 （选配）

qHOS可以在统计上确定光谱之间的显著差异，考虑各种误差因素，并具有以下特征。

• 统计相似性评估

• 使用噪声加权方法稳定评估

• Student, Welch, TOST t-test模式

• 自动浓度校正

• 正交相似性评估

• 遵守Spectra Manager™ CFR的规定

 

 

应用

 

治疗性抗体的光谱特性研究

这部分使用HTCD Plus和qHOS程序展示了对RIABNI™（与利妥昔单抗的原研药MabThera® / Rituxan®相似）和Herceptin®（曲妥珠单抗的原研药）进行HOS相似性评估的结果。

图1显示了MabThera®和Herceptin®三级结构的相似性评估结果。这些结果表明，该系统可以清楚地区分不同抗体药物的三级结构差异。

 

图1　不同抗体药物的HOS相似性评估结果

a）MabThera®（蓝）、Herceptin®（红）的平均光谱和MabThera®的标准偏差（灰）

b）MabThera®（蓝）、Herceptin®（红）的区域和测试结果

 

 

图2和图3显示了MabThera®和RIABNI™的二级和三级结构的相似性评估结果，这些结果分别客观地证实

了RIABNI™ 具有与MabThera®相同的三级和二级结构。

 

图2　使用远紫外圆二色光谱对利妥昔单抗的原研药（蓝）和生物仿制药（红）的HOS相似性进行评估的结果

a）MabThera®（蓝）、RIABNI™（红）的平均光谱和MabThera®的标准偏差（灰）

b）MabThera®（蓝）、RIABNI™（红）的距离和测试结果

 

图3　使用近紫外圆二色光谱对利妥昔单抗创新者（蓝）和生物仿制药（红）的HOS相似性进行评估的结果

a）MabThera®（蓝）、RIABNI™（红）的平均光谱和MabThera®的标准偏差（灰）

b）MabThera®（蓝）、RIABNI™（红）的距离和测试结果

 

通过CD/荧光光谱进行稳定性评估

已知CD和荧光光谱法是用于评估溶液中蛋白质构象的方法。通常，CD光谱和荧光光谱分别由不同的仪器获得。将HTCD Plus与荧光测量组件相结合，可以有效地获得这两种光谱。该系统在开发需要筛选以找到候选抗体的治疗性抗体方面是有效的。这显示了针对尿素的治疗性抗体（利妥昔单抗）的稳定性评估示例。

 

CD光谱法对抗体药物的稳定性评估结果

a）不同浓度尿素的抗体药物的CD光谱

b）213 nm处的CD信号作为一种尿素浓度的函数

 

荧光光谱法对治疗性抗体的稳定性评估结果

a）不同浓度尿素的治疗性抗体的荧光光谱

b）作为尿素浓度函数的荧光信号和最强荧光波长

 

二次结构估算的批量处理

蛋白质的二级结构因周围环境如pH和盐浓度的变化而变化。为了了解蛋白质在各种条件下的二级结构组成，应该使用HTCD Plus进行多次测量，并且优选从多次数据中自动获得二级结构估算结果。BeStSel CFR软件可以对多次光谱数据进行批量处理，用于二次结构估算，并可以直观地提供所有二次结构的估算结果。

 

VHH抗体里的pH和盐引起的变性研究

这显示了通过使用统计分析比较天然抗体和变性抗体的CD光谱来评估抗体的稳定性（VHH模型）的结果。 图1显示了具有不同pH值溶液的VHH抗体的CD光谱，图2显示了VHH抗体的结构随pH值和NaCl浓度变化的 估算结果。qHOS程序可以使用统计方法量化CD光谱的相似性，并可以定量评估与蛋白质结构变化相关的 CD光谱变化。

 

 

图3显示了通过HTCD获得的t值和通过变性温度测量获得的Tm的图。t值和变性温度之间的高度相关性表 明，在进行通常需要大量时间的热变性分析之前，光谱差异测试是一种非常有用的初步筛选方法。

 

 

在筛选分析中，需要10.5小时测量大约84个不同pH值和盐浓度的样品的CD光谱，然后使用qHOS程序计算t值。 使用自动6连池帕尔帖温度控制器和温度间隔测量程序将温度从20ºC变到82ºC，然后选择12个样品（2组6个 样品同时测量）来测量Tm值，这大概要花140分钟。HTCD plus对整组样本的有效评估只有12个小时。

 

VHH antibody was kindly provided by RePHAGEN https://rephagen.com/

 

Special thanks for collaboration; Prof. Kouhei Tsumoto, School of Engineering and Institute of Medical Science, The University of Tokyo

 

 

Spectra Manager™ CFR 遵从法规要求

 

JASCO Spectra Manager™ CFR是在ALCOA+下设计和开发的，是一个创建准确和完整数据的 整体解决方案平台。

 

 

 

数据完整性解决方案

 

持久电子记录

基于禁止删除电子记录和覆盖保存的功能，以及备份和恢复数据的功能，电子记录可以在数据使用周期中正确保存和准确搜索。

 

用户管理

基于双重安全类别（”访问级别”和”工作组”）， 可以在灵活独立的总体分析系统，仪器和分析应用程序中管理不同的授权流程。

 

审计跟踪

审计跟踪被分类为3种不同的记录（系统日志，应用程序日志和数据日志），并被分别记录。每个日志都可以在记录下进行筛选和显示日期、用户名等，并且可以导出以进行审计跟踪审查。

 

审计跟踪

审计跟踪被分类为3种不同的记录（系统日志，应用程序日志和数据日志），并被分别记录。每个日志都可以在记录下进行筛选和显示日期、用户名等，并且可以导出以进行审计跟踪审查。

 

计算机化系统验证（CSV）

Spectra Manager™ CFR是在符合ISO9001和CSV标准质量控制体系下正确开发和制造的。